Выделение ганглиозидов головного мозга

Принцип способа: одной из проблем в исследовании ганглиозидов является отсутствие относительно обычного способа получения незапятнанных соединении из тканевых экстрактов. Р. Блике, а потом К. Кленк в первый раз разработали способ выделения ганглиозидов мозга, основанный на избирательной экстракции их органическими растворителями. Этим методом создатели получали практически незапятнанные ганглиозиды, но с Выделение ганглиозидов головного мозга большенными потерями, что было не нужно, если принять во внимание относительно маленькое содержание и гетерогенность ганглиозидов. В тканях ганглиозиды ассоциированы с белками, потому во всех способах их выделения употребляются сильнополярные растворители и в главном экстракцию липидов из ткани производят консистенцией хлороформа с метанолом, как это было предложено Дж. Фолчем с Выделение ганглиозидов головного мозга сотрудниками. В распределительном способе ганглиозиды выделяли из общего липидного экстракта диализом против воды, при всем этом использовалась особенность ганглиозидов перебегать в аква раствор из органических растворителей. При диализе приобретенного экстракта против воды (процедура рассредотачивания) ганглиозиды перебегают в верхний аква слой, в то время как основная масса других липидов остается в Выделение ганглиозидов головного мозга нижнем хлороформном слое.

В измененном Л. Свеннерхольмом варианте рассредотачивания заместо воды используют слабенький солевой раствор. Этот способ употребляют обычно в тех случаях, когда довольно получить маленькое количество ганглиозидов. Тканевую экстракцию ганглиозидов можно проводить не только лишь консистенцией хлороформа с метанолом, да и другими растворителями. Так, Н. Трамс и Д. Лаутер Выделение ганглиозидов головного мозга предложили экстрагировать ганглиозиды из мозга тетрагидрофураном, а К. Кун и С. Вигандт применили для этих целей фосфатный буфер и оксибензол. Экстракция тетрагидрофураном заслуживает некого предпочтения перед другими растворителями. Тетрагидрофуран наращивает выход ганглиозидов на 8–15 % и содействует более полному выделению мультисиалоганглиозидов. Не считая того, тетрагидрофурановый способ в отличие Выделение ганглиозидов головного мозга от способа Фолча гарантирует выделение ганглиозидов, свободных от гликопротеинов, хотя дополнительно просит удаления фосфолипидов на колонке с силикагелем. Т. Сузуки улучшил способ Фолча, использовав для экстракции ганглиозидов смесь хлороформ – метанол в разных соотношениях. Тем была устранена неполная экстракция в водную фазу наименее полярных ганглиозидов. Независимо от метода экстракции во всех Выделение ганглиозидов головного мозга случаях выходит смесь личных ганглиозидов.

Для микроопределений ганглиозидов мозга употребляется модификация способа Фолча по Свеннерхольму и Сузуки.

Реактивы: 1) хлороформ; 2) метанол; 3) 0,1 % и 0,9 % смеси NaCl; 4) 0,1 М ЭДТА; 5) железный натрий; 6) концентрированная НС1; 7) 0,8 М раствор СН3СООNа; 8) 0,2 М раствор NaOH.

Ход работы: после декапитации крысы мозг извлекают из черепной коробки, высвобождают от Выделение ганглиозидов головного мозга кровеносных сосудов, промывают охлажденным 0,9 % веществом NaCl, обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают. Мозг гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с 5 мл консистенции хлороформа с метанолом (2:1) в течение 3 мин, гомогенат переносят в широкую пробирку с притертой пробкой и разводят этой же консистенцией из расчета 20 мл консистенции на 1 г ткани. Экстракцию общих липидов производят при Выделение ганглиозидов головного мозга 40 °С в течение 30 мин, временами встряхивая пробирки. Липидный экстракт фильтруют в цилиндр на 50 мл через складчатый картонный фильтр, за ранее обработанный консистенцией хлороформа с метанолом. Ткань обрабатывают повторно хлороформ-метаноловой консистенцией (1:2) для более полного извлечения ди- и трисиалоганглиозидов. Объединенные хлороформ-метаноловые экстракты выпаривают под вакуумом, а осадок растворяют Выделение ганглиозидов головного мозга в начальном объеме хлороформа с метанолом (2:1). Нерастворившуюся часть отфильтровывают, а фильтрат подвергают предстоящей обработке для выделения ганглиозидов.

Дж. Фолч с соавторами установили, что при обработке хлороформно-метанолового экстракта мозга разбавленными солевыми смесями образующаяся верхняя фаза содержит все ганглиозиды тканевого экстракта. К фильтрату добавляют 0,1 % раствор NaCl из расчета 0,2 мл на 1 мл липидного Выделение ганглиозидов головного мозга экстракта. Л. Свеннерхольм показал, что 0,1 % раствор NaCl более предпочтителен, чем предложенный Э. Сперри 0,02 % раствор СаСl. Добавление раствора KСl давало практически вдвое более маленький выход липидносвязанной N-ацетилнейраминовой кислоты.

После добавления раствора NaCl пробирку плотно закрывают притертой пробкой и энергично встряхивают до образования белоснежной эмульсии, которую оставляют на ночь Выделение ганглиозидов головного мозга в холодильнике. За этот период времени смесь, обычно, делится на две точные фазы: верхнюю – водно-метаноловую и нижнюю – хлороформную. Если расслоение не вышло, пробы центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин, после этого верхний водно-метаноловый слой, содержащий ганглиозиды, осторожно отсасывают и переносят в чистую пробирку. Для более полной экстракции ганглиозидов Выделение ганглиозидов головного мозга из нижней хлороформной фазы создают неоднократную дополнительную экстракцию ганглиозидов специально составленной консистенцией воды, метанола и хлороформа в соотношении 47 : 48 : 3. Смесь добавляют маленькими порциями к хлороформной фазе и повторяют все процедуры от образования эмульсии до ее разделения на 2 слоя, как при первой экстракции ганглиозидов 0,1 % веществом NaCl.

Присутствие ганглиозидов в верхней и Выделение ганглиозидов головного мозга нижней фазах обнаруживают по наличию в их N-ацетилнейраминовой кислоты нижеприведенным способом. Нижний хлороформный слой после 3-кратного промывания, обычно, не содержит N-ацетилнейраминовой кислоты и употребляется для определения цереброзидов и сульфатидов (см. с. 22).

Объединенный водно-метаноловый раствор, содержащий ганглиозиды, очищают от NaCl и других нелипидных водорастворимых низкомолекулярных Выделение ганглиозидов головного мозга примесей с помощью диализа в целлофановом мешочке поначалу против 0,1 М ЭДТА, а потом против огромного количества дистиллированной воды. Диализ производят в течение 2–3 сут при 4 °С, меняя воду в диализаторе 2–3 раза в день.

Очищенный диализом аква раствор ганглиозидов подвергают лиофилизации. Внедрение лиофилизации позволяет предупредить частичное тепловое разрушение ганглиозидов, неминуемое при всех Выделение ганглиозидов головного мозга видах выпаривания раствора.

Приобретенный после лиофилизации белоснежный лохматый порошок ганглиозидов растворяют в наименьшем объеме консистенции хлороформа с метанолом (2:1). Осадок, состоящий из денатурированного белка и неидентифицированных полимеров, избавляют центрифугированием либо фильтрованием, а растворимую фракцию подвергают предстоящей чистке от нейтральных липидов, фосфолипидов, сульфатидов.

Освобождение верхней фазы после лиофилизации от Выделение ганглиозидов головного мозга фосфолипидов и сульфатидов производят по способу Канфера. Для этого создают выпаривание растворимой хлороформ-метаноловой фракции и приобретенный осадок растворяют в 10 мл метанола, к которому добавляют несколько капель метилата натрия, приготовленного растворением маленького количества железного натрия в метаноле, при этом раствор обязан иметь рН 9,5–10,5. Раствор оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после Выделение ганглиозидов головного мозга этого добавляют смесь метанол-НС1 до рН среды, равного 2,0. Потом в раствор вводят 23 мл хлороформа, отлично перемешивают и добавляют 6,8 мл 0,1 % раствора NaCl. Смесь энергично встряхивают и после центрифугирования верхнюю фазу убирают и сохраняют. Проводят еще две дополнительные промывки консистенцией хлороформ – метанол – вода (3 : 48 : 47). Объединенные верхние фазы концентрируют на роторном Выделение ганглиозидов головного мозга испарителе до 10 мл и диализируют против дистиллированной воды. В итоге чистки раствор освобождается от фосфолипидов и сульфатидов.

Приобретенный после диализа раствор лиофилизируют, осадок растворяют в 50 мл консистенции хлороформ – метанол – вода (30 : 60 : 8) и наносят на колонку с анионитом. В колонку размером 20 · 1,5 см вводят 2,2 г ДЕАЕ-сефадекса А-25, промытого пару раз веществом метанол Выделение ганглиозидов головного мозга – хлороформ – 0,8 М CH3COONa (30 : 60 : 8) с следующим уравновешиванием тем же веществом. Такая обработка переводит смолу из хлоридной в ацетатную форму, что делает условия для работы с органическими растворителями. Смолу промывают пару раз приблизительно 100–200 мл раствора хлороформ – метанол – вода (30 : 60 : 8).

На колонку наносят раствор ганглиозидов, после неспешного пропускания эталона колонку элюируют 150 мл Выделение ганглиозидов головного мозга такого же растворителя, чтоб удалить все незаряженные примеси. Потом ганглиозиды элюируют 180 мл консистенции метанол – хлороформ – 0,8 M CH3COONa (60 : 30 : 8). Растворитель убирают выпариванием, а к осадку добавляют 10–20 мл 0,2 н. NaOH в СН3ОН и проводят инкубацию в течение 1 ч при 37 °С, временами встряхивая. Потом раствор выпаривают до 1/4 от начального объема, добавляют Выделение ганглиозидов головного мозга излишек воды и пробы диали-зируют против дистиллированной воды в течение 2 сут. Содержимое диализационного мешочка лиофилизируют. Приобретенные таким макаром ганглиозиды инспектируют на присутствие фосфора, холестерина и белка. Если ни одно из перечисленных соединений не найдено, это дает основание считать ганглиозиды незапятнанными. Незапятнанные ганглиозиды мозга могут употребляться дальше для Выделение ганглиозидов головного мозга количественной оценки и хроматографического разделения на узком слое на личные ганглиозиды.


videorolik-chto-delegirovat-741-min.html
videorolik-socialnaya-reklama.html
videoteka-fonoteka-i-biblioteka-shkoli.html